Warum ist dieses Wissen wichtig? | Das Programm PyMOL bietet einen enormen Funktionsumfang, um Proteinstrukturen zu visualisieren, zu analysieren und abzuändern. Um komplexere Fragestellungen bearbeiten zu können, müssen wir uns einige weitere Funktionen erarbeiten. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Verweis |
Diese Übungen ergänzen die Kapitel 19 "Vergleich von
Protein-3D-Strukturen" und 20 "Vorhersage der
Protein-3D-Struktur, Proteindesign und Moleküldynamik". |
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Lernziel |
Nach dem Bearbeiten dieser Übungen sollten Sie
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Voraussetzungen | Für die folgenden Übungen benötigen
Sie ein lokal installiertes PyMOL-Programm. Zudem sollten Sie die Übungen zur Visualisierung von Protein-3D-Strukturen bereits absolviert haben. Die Installation von PyMol ist hier beschrieben. |
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Übung | ProtMut_1, Reaktionszentrum eines Enzyms darstellen | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Motivation | Metallo-β-Lactamasen
sind Zink-abhängige Hydrolasen, die β-Lactam-Antibiotika
deaktivieren. Bakterien, die diese Enzyme besitzen, sind deswegen
resistent gegen die genannten Antibiotika. Aus diesem Grund ist es
wichtig, die genaue Funktion des Enzyms zu kennen. Ein Teilaspekt bei
der Funktionsaufklärung ist die Kenntnis der genauen Struktur des
aktiven Zentrums und das Wissen zur Funktion der einzelnen Residuen. Vor Position 120 dieses Enzyms ist bekannt, dass sie bei der Katalyse von zentraler Bedeutung ist. Zudem ist die Besetzung dieser Position strikt konserviert: In einem multiplen Sequenzalignment von Metallo-β-Lactamasen findet sich dort nur Asp. Die genaue Rolle dieses Residuums bei der Enzymfunktion war lange Zeit unklar. Üblicherweise werden in solchen Fällen Protein-Mutanten hergestellt und vermessen. Im konkreten Fall werden an Position 120 mithilfe molekularbiologischer Methoden unterschiedliche Reste eingeführt und die Veränderungen in der Enzymfunktion mit biochemischen und biophysikalischen Methoden studiert. In dieser Übung betrachten wir zunächst das aktive Zentrum des Enzyms. Wir gehen hierbei von einer Mutante aus, in der das Asp an Position 120 durch Serin ersetzt wurde. Diese Arbeiten sind in dieser Publikation beschrieben, an der wir uns im Folgenden orientieren. Als Ergebnis der genannten Studien wurde postuliert, dass Asp-120 als starker Zink-Ligand wirkt, das Ion optimal im Hinblick auf Substratbindung positioniert und an der Ausbildung einer partiellen negativen Ladung beteiligt ist. |
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Besorgen Sie sich die erforderlichen Datensätze. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Datensätze lokal speichern | Laden Sie aus aus der PDB-Datenbank oder vom NCBI den Datensatz 2BC2.pdb und speichern Sie ihn in einem lokalen Verzeichnis. Der zweite Datensatz ist der von 2UYX.pdb. Um Ihnen die Arbeit zu erleichtern, wurden aus dem Originaldatensatz 2UXY.pdb für diese Übung einige, hier nicht relevante Atome entfernt. Bitte speichern Sie diese, modifizierte Version (genannt 2UYXmod.pdb) lokal auf Ihrem Rechner ab. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Datensatz laden | Laden Sie nun 2UYXmod in PyMOL. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Inhalt untersuchen | Verschaffen Sie sich
zunächst eine Übersicht: Aktivieren Sie dazu die Sequenzanzeige. Der Datensatz enthält eine Kette (A) sowie zwei Hetero-Atome (Zink), die zum Reaktionszentrum gehören. Diese Atome werden ganz rechts in der Liste aufgeführt. |
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Cartoon-Darstellung wählen | Lassen Sie sich
zunächst von der Kette A eine Cartoon-Darstellung
anzeigen: Klicken Sie dazu in der Auswahlliste auf das S neben 2UYXmod und wählen Sie as/cartoon. Verändern Sie die Farbe der Cartoon-Darstellung z.B. mit C/by ss/Helix Sheet Loop. |
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Zink-Atome hervorheben | Lassen Sie die
Zink-Atome nun mit ihren van der Waals-Radien darstellen: Selektieren Sie beide Zn-Atome in der Sequenzzeile. Sie werden nun als Selektion (sele) in der Auswahlliste angezeigt. Wählen Sie für diese Auswahl S/as/spheres und kolorieren Sie die beiden Atome in der Farbe gray50. |
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Situation studieren | Betrachten Sie nun das
Modell. Es sind nun die Proteinstruktur und die beiden Zink-Atome
erkennbar. Allerdings werden die intimen Wechselwirkungen in dieser
Darstellung nicht sichtbar. |
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Aktives Zentrum genauer darstellen | Laut Publikation sind die folgenden Residuen an der Koordination der Zinkatome beteiligt und bilden das aktive Zentrum: | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
His116, His118, Asp120, His196, Cys 221, His263. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Weiterhin sind zwei Wassermoleküle in die Bindung
mittels Wasserstoffbrückenbindungen involviert, diese
Wassermoleküle sind in dieser Kristallstruktur allerdings nicht
sichtbar. Aufgrund der
Mutation wird die Position 120 nicht gefunden. Reinitialisieren Sie zunächst PyMOL und laden Sie danach
den Datensatz 2UYXmod.pdb neu. Lassen Sie sämtliche Wasserstoffatome, die im
PDB-Datensatz nicht enthalten sind, hinzufügen mit A/hydrogens/add.
Die Existenz dieser Wasserstoffe ist für die folgenden Analysen
wichtig. Deaktivieren Sie nun jegliche Darstellung (H/everything). Wir wollen nun auch die unmittelbare 3D-Umgebung des Residuums
darstellen lassen. Selektieren Sie dazu alle Residuen im Umkreis von 6 Angström um Ser120. Aktivieren Sie für
diese Selektion die Lines-Darstellung
und ändern Sie die Farbe zu grau. Lassen Sie von den Zinkatomen die van der Waals
Oberflächen in braun darstellen (zu finden in der Farbgruppe rot). Benutzen Sie die Funktion Wizard/Mutagenesis
und picken Sie die Ser120-Seitenkette. Ändern Sie die
Aminosäure von No Mutation zu Mutate
to ASP. Die für jedes Rotamer zusätzlich angezeigten
farbigen Scheiben und Striche bedeuten folgendes: Entscheiden Sie sich für ein Rotamer, dass
möglichst wenig sterische Probleme einführt. Bestätigen Sie ihre Wahl mit Apply.
Erst dann wird die Mutation wirklich durchgeführt. Mit Done
können Sie den Mutagenesis Wizard beenden. Sie können Ihre Rotamerwahl noch zusätzlich auf
energetisch günstige polare Interaktionen überprüfen. Selektieren Sie dazu das mutierte Residuum Asp120 und
wählen Sie die Option A/find/polar
contacts/to other atoms in object. Es sollten nun
mindestens drei, optimalerweise vier Wechselwirkungen angezeigt werden. Falls nicht,
überprüfen Sie nochmals die Rotamerwahl. Im Viewer sind nun zwei Datensätze geladen. Zunächst
wollen wir die Datensätze superpositionieren und uns dabei auf die
CA-Atome beschränken. Der Kommandozeilenbefehl dafür lautet: align (2B2C and name ca), (2UYXmod and name ca) In der Anzeige des Menüfensters wird mit dem RMSD-Wert
ein Maß für die Qualität der Überlagerung
angegeben. Der Wert von 0.257 Angström entspricht der mittleren
Abweichung von 185 einander zugeordneten CA-Atomen und somit einer fast
perfekten Überlagerung. Die bisher erzielten Ergebnisse belegen, dass wir
in der Lage sind, mit relativ einfachen Mitteln die Position der
Seitenketten zumindest annähernd zu bestimmen. Allerdings
können wir anhand dieser Betrachtung keine Aussage über den
Effekt der Mutation auf die Stabilität des Proteins oder die
Enzymaktivität machen. Für eine genauere Bewertung des Einflusses von Mutationen
auf die Proteinstabilitäten bietet die Bioinformatik andere
Werkzeuge. Zu den bekanntesten Programmpaketen für die Zwecke des
Enzymdesigns gehört RosettaDesign,
das auch als frei verfügbarer Webserver genutzt werden kann. Sie
können sich dort anmelden und eine PDB-Datei zusammen mit einer
Liste der gewünschten Mutationen übergeben. Je nach Auslastung müssen Sie auf die Ergebnisse mehrere
Tage warten. Daher finden Sie hier bereits die Ergebnisse für die Ausgangsstruktur (2UYX) und die Punktmutante (S120D), die dem wildtypischem
Enzym entspricht. Speichern Sie die beiden Dateien lokal und
öffnen Sie diese mit einem Texteditor (z.B. Notepad++). Die Dateien beinhalten zum einen die Struktur im PDB-Format
und im zweiten Abschnitt eine detaillierte Tabelle mit zahlreichen
Energiewerten. Die für Sie relevanten Informationen finden Sie in
den Zeilen beginnend mit pose und SER_81
bzw. ASP_81. Der Wert für die
Gesamtenergie steht jeweils am Ende der Zeile. Die Energiewerte (Rosetta-Scores) können NICHT direkt
physikalisch interpretiert werden, allerdings gilt auch hier, dass eine
negativerer Wert einer höheren Proteinstabilität entspricht. Welchen Effekt auf die Stabilität des Proteins
erwarten Sie durch die Punktmutation? Beachten Sie, dass die Aminosäure Asp an
dieser Stelle in natürlich vorkommenden Enzymen streng konserviert
ist. Um die Übereinstimmung der aktiven Zentren zu
überprüfen, sollen Sie sich folgende Residuen und
Hetero-Atome anzeigen lassen: Färben Sie beide aktive Zentren unterschiedlich ein. Was Sie jetzt verstanden haben sollten |